為探究Bcl-2相關(guān)抗凋亡蛋白3（BAG3）在細(xì)胞自噬中的作用，科研人員計劃從質(zhì)粒A中獲取BAG3基因，將其接入質(zhì)粒pGEX-4T1，然后在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目標(biāo)蛋白，用于后續(xù)研究。請回答下列問題：

（1）BAG₃的基因序列如圖2所示。由于BAC3基因兩側(cè)沒有合適的酶切位點，并確定內(nèi)部不含有EcoRI、XhoI限制酶的識別序列。在設(shè)計引物時，需將引物與限制酶的識別序列相連，以便將目的基因與載體相連。設(shè)計出的引物是

AD

AD

。
A．引物5'-TTGAATTCATGAGCGCCGCCACCCACTC-3'
B．引物5'-TTGAATTCTACTCGCGGCGGTGGGTGAG-3'
C．引物5'-TAGAGCTCCGGTGCTGCTGGGTTACCAC-3'
D．引物5'-TACTCGAGCGGTGCTGCTGGGTTACCAG-3'
（2）合成引物后，以

質(zhì)粒A

質(zhì)粒A

為模板進(jìn)行PCR，為了確認(rèn)是否擴(kuò)增出了目的基因，可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行

電泳

電泳

，取出凝膠置于紫外燈下觀察照相，與DNAmarker（標(biāo)準(zhǔn)參照物）進(jìn)行對比，切下含目的基因片段的瓊脂糖凝膠，通過試劑盒回收目的基因。
（3）用雙酶切法分別處理回收的目的基因和pCEX-4TI質(zhì)粒，為了提高目的基因與表達(dá)質(zhì)粒的連接效率，需要排除

酶切后的非目標(biāo)片段

酶切后的非目標(biāo)片段

的干擾。
（4）用

Ca²⁺

Ca²⁺

處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于一種能

吸收周圍環(huán)境中DNA分子

吸收周圍環(huán)境中DNA分子

的生理狀態(tài)，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒導(dǎo)入其中。為了篩選出工程菌，以便后期提取質(zhì)粒，檢測是否含有目的基因片段，請寫出工程菌的純培養(yǎng)過程。

在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落接種到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)

在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落接種到液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)

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