凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵性酶。直接利用動、植物生產(chǎn)凝乳酶受多種因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌種是目前最有前途的發(fā)展方向。從牛胃液中分離到的凝乳酶以催化能力強而被廣泛應(yīng)用，研究人員運用基因工程技術(shù)，將編碼該酶的基因轉(zhuǎn)移到了微生物細胞中。
（1）從牛胃細胞中提取

mRNA

mRNA

，再逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以此cDNA為模板PCR擴增目的基因，有時需要在引物的5′端設(shè)計

限制酶

限制酶

（填“限制酶”“DNA連接酶”或“RNA聚合酶”）識別序列，以便構(gòu)建重組DNA分子。

（2）構(gòu)建重組DNA分子（如圖1所示）最好選用

BamHⅠ和 PstⅠ

BamHⅠ和 PstⅠ

限制酶，理由是

在不破壞目的基因的基礎(chǔ)上，雙酶切割可使質(zhì)粒和目的基因形成相同的黏性末端，防止錯連

在不破壞目的基因的基礎(chǔ)上，雙酶切割可使質(zhì)粒和目的基因形成相同的黏性末端，防止錯連

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若研究人員獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組質(zhì)粒，如圖2所示。這三種重組質(zhì)粒中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有

甲和丙

甲和丙

，不能表達的原因是

甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游（甲、丙中目的基因不在啟動子和終止子之間），兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄

甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游（甲、丙中目的基因不在啟動子和終止子之間），兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄

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（3）工業(yè)化生產(chǎn)過程中，最初多采用重組大腸桿菌或芽孢桿菌生產(chǎn)凝乳酶，現(xiàn)多采用重組毛霉生產(chǎn)，相較于大腸桿菌，毛霉作為受體細胞的優(yōu)勢是

含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可對蛋白質(zhì)進行加工和修飾

含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，可對蛋白質(zhì)進行加工和修飾

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（4）研究發(fā)現(xiàn)，如果將該凝乳酶的第20位和第24位氨基酸改變?yōu)榘腚装彼?，其催化能力將提?倍。通過蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)高效凝乳酶，所需步驟有

b、a、d、e

b、a、d、e

。
a.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)設(shè)計
b.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析
c.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的定向改造
d.凝乳酶基因的定向改造
e.將改造后的凝乳酶基因?qū)胧荏w細胞
f.將定向改造的凝乳酶導(dǎo)入受體細胞