綠色熒光蛋白（GFP）是水母體內(nèi)的一種發(fā)光蛋白，其編碼基因可作為基因工程中載體上的標(biāo)記基因。研究人員在pBIN19質(zhì)粒的LacZ基因（β-半乳糖苷酶基因）內(nèi)部插入GFP基因和CaMV35S（強(qiáng)啟動(dòng)子）構(gòu)建成可用于培育轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)粒載體pBIN-35S-GFP（如圖所示）?；卮鹣铝袉?wèn)題：

注：質(zhì)粒上“LB→……←RB”片段為T(mén)-DNA片段，Kmr基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?，質(zhì)粒上限制酶的識(shí)別序列省略未標(biāo)出。
（4）構(gòu)建pBIN-35S-GFP載體的過(guò)程中需要用到

限制酶和DNA連接

限制酶和DNA連接

酶，要插入CaMV35S的目的是

啟動(dòng)GFP基因的表達(dá)

啟動(dòng)GFP基因的表達(dá)

，因此CaMV35S需插入到GFP基因的

上游

上游

。
（5）已知β-半乳糖苷酶能將無(wú)色的X-gal分解為半乳糖和藍(lán)色的5-溴-4-氯靛藍(lán)。把GFP基因和CaMV35S插入到LacZ基因的內(nèi)部，除了通過(guò)菌落是否產(chǎn)生綠色熒光來(lái)篩選導(dǎo)入質(zhì)粒pBIN-35S-GFP外，還可以通過(guò)添加了

卡那霉素和X-gal

卡那霉素和X-gal

培養(yǎng)基，菌落顏色呈

白

白

色的就是導(dǎo)入了質(zhì)粒pBIN-35S-GFP的受體菌的克隆。
（6）若用pBIN-35S-GFP載體采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作，外植體轉(zhuǎn)化完成后常用抗生素進(jìn)行除菌。若利用PCR技術(shù)判定農(nóng)桿菌是否已經(jīng)除盡，可根據(jù)

oriV或oriT或Km^r

oriV或oriT或Km^r

（填圖中質(zhì)粒片段名稱(chēng)）基因的序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，若

無(wú)PCR產(chǎn)物條帶

無(wú)PCR產(chǎn)物條帶

，說(shuō)明外植體中已無(wú)農(nóng)桿菌殘留。
（7）綠色熒光蛋白基因可作為基因工程中載體上的標(biāo)記基因。綠色熒光蛋白則可用于研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位，原因除了綠色熒光蛋白能夠發(fā)熒光外，還有一重要原因是GFP結(jié)合到被研究的目的蛋白的末端，不影響該蛋白的

生物學(xué)活性

生物學(xué)活性

，還是按照無(wú)GFP結(jié)合的蛋白同樣的路徑運(yùn)轉(zhuǎn)。要使GFP結(jié)合到目的蛋白的末端，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)目的基因、GFP基因、CaMV35S的連接順序?yàn)?

CaMV35S→目的基因→GFP基因

CaMV35S→目的基因→GFP基因

（用“→”回答）。