可用作生物表面活性劑的鼠李糖脂不僅具有優(yōu)異的功能穩(wěn)定性，還具有無毒、無污染、可被生物降解等優(yōu)點(diǎn)，因而在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、石油開采、環(huán)境污染修復(fù)等領(lǐng)域展示了其獨(dú)特的應(yīng)用前景?？珊铣墒罄钐侵奶烊痪甏嬖谥虏⌒缘热秉c(diǎn)，而異源菌株中往往存在合成鼠李糖脂的重要前體物質(zhì)，理論上只要將外源基因插入該菌株進(jìn)行異源表達(dá)即可合成鼠李糖脂。某科研團(tuán)隊(duì)選擇在無致病的異源菌株惡臭假單胞菌（P.jye.ai）中插入外源基因rhIA以合成鼠李糖脂。已知表達(dá)載體pBBRmcs-5的MCS含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，Gm^R為慶大霉素的抗性基因。請(qǐng)回答：

（1）利用PCR技術(shù)獲取外源基因rhIA：以下可提供外源基因rhIA模板的菌株有

③④

③④

。
①P.jye.ai②E.coli③P.aeruginosa④Burkholderia sp
（2）因外源基因rhIA不含有MCS中的限制酶酶切位點(diǎn)，需對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。二次PCR所使用的引物應(yīng)該在第一次PCR引物的

5′

5′

（填“3′”或“5′”）端插入包含限制酶酶切位點(diǎn)的序列。在上游引物所插入的序列含有5′AGGGCGAATTGGAGCTC3′，下游引物插入的序列含有5′GCTTGATATCGAATTCGA3′。
（3）基因表達(dá)載體構(gòu)建：將表達(dá)載體pBBRmcs-5與上述擴(kuò)增產(chǎn)物用SacⅠ和

EcoRⅠ

EcoRⅠ

限制性核酸內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行連接。
（4）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：用

Ca²⁺（或CaCl?）

Ca²⁺（或CaCl?）

處理P.jye.ai使其處于能夠吸收外源DNA的生理狀態(tài)，與上述基因農(nóng)達(dá)載體混合培養(yǎng)一段時(shí)間。
（5）目的基因的檢測與鑒定：
①用稀釋涂布法將培養(yǎng)液接種到含慶大霉素的

選擇

選擇

（填“選擇”或“鑒別”）培養(yǎng)基上培養(yǎng)以檢測表達(dá)載體是否導(dǎo)入重組菌株。
②通過PCR技術(shù)可檢測

ab

ab

。
a.表達(dá)載體pBBRmcs-5是否含有外源基因rhIA
b.外源基因rhIA是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
c.外源基因rhIA是否表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)
③測定發(fā)酵液中

鼠李糖脂

鼠李糖脂

的含量。