γ-亞麻酸（GLA）是人體和動物飲食中具有營養(yǎng)作用的重要的多烯不飽和脂肪酸，在大多數(shù)油料作物種子中不含有GLA，而只含有其前體物亞油酸。△⁶-脂肪酸脫氫酶（D6D）可將亞油酸轉(zhuǎn)化為GLA，為了能夠在傳統(tǒng)的油料作物種子中產(chǎn)生GLA，研究者將從深黃被孢霉中克隆的D6D基因，與植物表達載體pGA643連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGAMICL6，采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入模式植物煙草中。經(jīng)測定證明，轉(zhuǎn)基因煙草表達的GLA占其總脂肪酸含量的19.7%。
（1）科學(xué)家從深黃被孢霉的細胞質(zhì)中提取到了D6D的mRNA，已知該mRNA的部分堿基序列為：
3-′UUCAGG…………………………ACCCCG-5′
科學(xué)家通過逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得了對應(yīng)的cDNA，通過PCR技術(shù)擴增該cDNA時，兩條引物的序列應(yīng)為：
①5'-

AAGTCC

AAGTCC

-3'
②5'-

GCCCCA

GCCCCA

-3'
（2）圖1為pGA643和D6D基因的結(jié)構(gòu)示意圖，以及五種限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列。為了構(gòu)建pGAMICL6，需要使用

BamHI和NotI

BamHI和NotI

斷開pGA643，使用

Sau3AI和NotI

Sau3AI和NotI

切割深黃被孢霉基因獲得D6D。PGAMICL6中除了含有目的基因、標記基因之外，還必須含有

啟動子、終止子

啟動子、終止子

等結(jié)構(gòu)。

限制酶	BamHⅠ	HaeⅢ	MclⅠ	Sau3AⅠ	NotⅠ
識別序列及切割位點	G↓GATCC CCTAG↑G	GG↓CC CC↑GG	T↓GATCA ACTAG↑A	↓GATC CTAG↑	GC↓GGCCGC CGCCGG↑CG

（3）將pGAMICL6與感受態(tài)農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)一段時間后，將農(nóng)桿菌置于含有

四環(huán)素

四環(huán)素

的培養(yǎng)基A中進行培養(yǎng)，再使用影印法將菌種接種到含有

氨芐青霉素

氨芐青霉素

的培養(yǎng)基B中進行培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示，則菌落

3、6

3、6

是含有pGAMICL6的農(nóng)桿菌。