非霍奇金淋巴瘤是一種原發(fā)于淋巴組織的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其細胞表面高表達CD19蛋白。CAR-T（嵌合抗原受體T細胞）療法是利用基因工程的方法使T細胞表面表達能夠靶向特定抗原的受體（CAR），改造后的T細胞被稱為CAR-T，可以識別并攻擊帶有特定抗原的腫瘤細胞，同時激活機體自身免疫從而達到抗腫瘤的效果。請回答下列問題：
（1）目前制備CAR-T細胞大多是采用慢病毒感染的方式使T細胞表達CAR。
①獲取CAR基因（實質(zhì)為抗CD19蛋白的抗體基因）：將抗CD19蛋白的抗體基因作為PCR反應的模板，并依據(jù) 抗CD19蛋白抗體基因兩端的部分核苷酸序列抗CD19蛋白抗體基因兩端的部分核苷酸序列設計一對特異性引物來擴增該基因。
②構建基因表達載體：圖1為所用載體示意圖，圖2為限制酶的識別序列及切割位點。為使目的基因與載體正確連接，在擴增目的基因時，應在其一對引物的 5’5’端分別引入 Pvit2、EcoRIPvit2、EcoRI兩種不同限制酶的識別序列。在目的基因和載體連接時，可選用 T4DNA連接酶T4DNA連接酶（選填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。
③將目的基因?qū)胧荏w細胞：將重組質(zhì)粒通過 顯微注射顯微注射技術導入到T細胞。
④重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：將轉(zhuǎn)化后的T細胞置于含 嘌呤霉素嘌呤霉素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，進一步通過流式細胞術驗證CAR-T細胞的構建是否成功。
（2）采用病毒作為遞送載體存在隨機插入的安全隱患，CRISPR/Cas9技術作為第三代基因編輯工具（圖3），sgRNA可引導Cas9蛋白在特定位點進行切割來完成基因的編輯?？茖W家利用該技術制備的CAR-T細胞，在非霍奇金淋巴瘤臨床前的治療中取得理想效果。其操作原理如圖4所示。
①sgRNA能與靶基因特異性識別、結合的原理是 （sgRNA與靶基因）堿基互補配對（sgRNA與靶基因）堿基互補配對，基因編輯工具中對基因進行剪切的是 Cas9蛋白Cas9蛋白。
②腫瘤細胞表面的PD-L1蛋白和T細胞表面的PD-1受體結合，發(fā)出免疫抑制信號，實現(xiàn)免疫逃逸。該研究團隊利用CRISPR/Cas9技術切割T細胞中PD-1基因的同時導入靶向PD-1基因的同源重組序列，利用同源重組修復的原理將 抗CD19蛋白的抗體基因抗CD19蛋白的抗體基因重組在PD-1基因內(nèi)部，制備了非病毒定點整合的CAR-T細胞，如圖4。
③綜合上述信息分析，與慢病毒制備的CAR-T細胞相比，該方案制備的CAR-T細胞在非霍奇金淋巴瘤的治療中的優(yōu)點有：可以 定向定向插入抗CD19蛋白的抗體基因，降低隨機插入的安全隱患，提高CAR-T細胞的安全性；可以使PD-1基因突變，降低腫瘤細胞 免疫逃逸免疫逃逸的可能性，提高CAR-T細胞的有效性。
【答案】抗CD19蛋白抗體基因兩端的部分核苷酸序列；5’；Pvit2、EcoRI；T4DNA連接酶；顯微注射；嘌呤霉素；（sgRNA與靶基因）堿基互補配對；Cas9蛋白；抗CD19蛋白的抗體基因；定向；免疫逃逸
【解答】
【點評】
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