人乳鐵蛋白（hLF）對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒等都有抑制作用。研究人員開(kāi)展人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染研究，主要流程如圖。RT-PCR過(guò)程需先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，然后再進(jìn)行PCR。圖中AseⅠ、NheⅠ、SalⅠ、BamHⅠ代表相關(guān)限制酶切點(diǎn)，neor為新霉素抗性基因，BLG基因?yàn)锽乳鐵蛋白基因，GFP基因?yàn)榫G色熒光蛋白基因。請(qǐng)回答：

（1）過(guò)程①中，不能從人肌肉細(xì)胞中提取RNA用于RT-PCR，是因?yàn)?!--BA-->

hLF基因在人肌肉細(xì)胞中不表達(dá)（或人肌肉細(xì)胞中沒(méi)有相應(yīng)的mRNA）

hLF基因在人肌肉細(xì)胞中不表達(dá)（或人肌肉細(xì)胞中沒(méi)有相應(yīng)的mRNA）

。在RT-PCR過(guò)程中，加入的引物需在

5’

5’

端添加

SalⅠ和BamHⅠ

SalⅠ和BamHⅠ

兩種限制酶的識(shí)別序列，以便于hLF基因插入pEB質(zhì)粒中。
（2）過(guò)程②中，hLF基因插入到BLG基因之后的目的是

使hLF基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)（或使目的基因表達(dá)）

使hLF基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)（或使目的基因表達(dá)）

。
（3）過(guò)程③中利用磷脂分子構(gòu)成脂質(zhì)體介導(dǎo)的原理是

利用生物膜的流動(dòng)性使脂質(zhì)體與山羊乳腺上皮細(xì)胞融合，從而將（重組）質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞

利用生物膜的流動(dòng)性使脂質(zhì)體與山羊乳腺上皮細(xì)胞融合，從而將（重組）質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞

。我們還學(xué)過(guò)利用

顯微注射

顯微注射

法將基因表達(dá)載體導(dǎo)入動(dòng)物受體細(xì)胞。
（4）將轉(zhuǎn)染后的山羊乳腺上皮細(xì)胞先置于含新霉素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，能夠存活的細(xì)胞應(yīng)該是導(dǎo)入

pEB質(zhì)粒（或普通質(zhì)粒）、pEBL質(zhì)粒（或重組質(zhì)粒）

pEB質(zhì)粒（或普通質(zhì)粒）、pEBL質(zhì)粒（或重組質(zhì)粒）

的細(xì)胞，再利用熒光顯微鏡觀察山羊乳腺上皮細(xì)胞中

是否有綠色熒光

是否有綠色熒光

，以篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。
（5）科研過(guò)程中，也可以用PCR技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞是否成功轉(zhuǎn)入了目的基因。提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有

①③

①③

。
①模板受到污染
②退火溫度過(guò)高
③引物太短
④延伸溫度偏低